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2017年 第34卷 第02期    刊出日期：2017-04-29

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研究 论著

EＲK 信号通路调控 Spink3 在肝癌中的表达

王康伟, 王欣欣, 戎卓娜, 樊婷婷, 李 娟, 王玉琨, 王福金, 王爱国, 王靖宇

2017, 34(02):  1-6. 

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摘要: 目的 探究 Spink3 在小鼠肝癌组织中的表达调控机制。方法 采用 ＲT-qPCＲ 方法检测 SPINK1 在人肝癌及 Spink3 在 H-ras12V 转基因肝癌中的 mＲNA 表达水平。采用 Western blot 和 ＲT-qPCＲ 法检测原代培养小鼠肝癌组织和肝癌旁组织中的 EＲK 和 mTOＲ 信号通路的变化及 Spink3 的 mＲNA 表达水平。体内抑制 EＲK 和 mTOＲ 信号分子活性，检测其对 Spink3 mＲNA 表达水平的影响。结果 与肝癌旁组织相比，SPINK1 和 Spink3 的 mＲNA 水平分别在人肝癌组织和小鼠肝癌组织中显著升高 ( P ＜ 0. 05) 。在原代培养的小鼠肝癌和肝癌旁组织中，与 0 h 相比，随着体外培养时间的延长( 6、12、24、48 h) ，p-EＲK 和 p-mTOＲ 信号分子水平明显下降; 与此相一致，Spink3 的 mＲNA 的表达水平也显著降低( P ＜ 0. 01) 。体内抑制 EＲK 信号分子的活性，显著下调了 Spink3 的 mＲNA 表达水平 ( P ＜ 0. 05) 。但体内抑制 mTOＲ 信号分子的活性，对 Spink3 的 mＲNA 表达没有显著影响。结论 SPINK1 / Spink3 在肝癌组织中过表达，有望成为肝癌的临床诊断指标。EＲK 通路可能是上调 Spink3 表达的主要信号通路。

Pumilio1 /Pumilio2 双基因条件性敲除小鼠模型的建立及基因型鉴定

杨 定, 张诗坤, 徐宇君

2017, 34(02):  7-10. 

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摘要: 目的 建立及鉴定 Pumilio1 /Pumilio2( Pum1 和 Pum2) 双基因条件性敲除的小鼠模型，为进一步研究 PUF 家族在哺乳动物精子发生中的生物学功能奠定基础。方法 将构建的 Pum1 条件性敲除和 Pum2 条件性敲除的两个品系小鼠进行交配并繁殖，最终繁殖成功的子代小仔 Pum1 和 Pum2 两个基因均为纯合子。对子代以剪趾方式进行编号，提取子代小鼠脚趾或鼠尾基因组 DNA，用 PCＲ 法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型。结果 Pum1 和 Pum2 双基因条件性敲除的小鼠模型繁殖成功，同时获得更多 PUF 家族双基因条件性敲除的小鼠。结论 成功建立了 Pum1 和 Pum2 双基因条件性敲除的小鼠模型; 正确的交配繁殖策略和鉴定方法是获得 PUF 家族双基因条件性敲除小鼠的有效途径。

树鼩小肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定

尹博文, 陈玲霞, 李振宇, 李晓飞, 宋庆凯, 苗雨润, 孙晓梅

2017, 34(02):  11-15. 

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摘要: 目的 从树鼩小肠分离小肠上皮细胞，探索分离培养方法和条件，为药物开发和病原感染机制研究提供体外细胞模型，并且为建立树鼩小肠上皮细胞系奠定基础。方法 采用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ及 DTT 联合消化树鼩小肠组织块，得到的细胞经完全培养液培养，用相差显微镜观察细胞形态，通过 MTT 法测定细胞生长曲线，并采用细胞角蛋白荧光染色等方法鉴定细胞。结果 经优化分离法得到的肠上皮隐窝细胞团在 24 h 后贴壁，6 d 汇合成片，在显微镜下观察发现细胞团延辐射状向外长出铺路石样和多角状的细胞; 第二代后，每隔 2 ～ 3 d 可传代 1 次; 细胞接种 3 ～ 6 d 为对数生长期; 细胞角蛋白 18 进行免疫荧光鉴定后确定为小肠上皮细胞。结论 本实验成功地从树鼩小肠分离到了小肠上皮细胞，并且建立了树鼩小肠上皮细胞体外培养的方法。

去除信号肽有利鸡白细胞介素-10 在哺乳动物细胞胞浆的表达

彭蔚宇, 王丽廷, 王兴童, 杨 柳, 孟 兴, 陈洪岩, 韩凌霞

2017, 34(02):  16-20. 

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摘要: 目的 分析鸡白细胞介素 10( chicken interleukin-10，chIL-10) 的信号肽对体外表达的影响，以获得稳定表达 chIL-10 的细胞系。方法 采用 ＲT-PCＲ 方法从经脂多糖( LPS) 体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中分别扩增含信号肽( euchIL-10F) 和去信号肽( euchIL-10M) 的 chIL-10 编码基因，克隆入含有报告基因 eGFP 和新霉素抗性基因 ( neo) 的真核表达载体 pEGFP-N1 中，获得重组质粒 N1-euchIL-10F 和 N1-euchIL-10M。分别转染中国仓鼠卵巢细胞系( CHO-K1) ，经 G418 加压筛选、纯化，获得稳定表达 chIL-10 蛋白的 CHO-K1 细胞系，利用激光共聚焦试验观察外源蛋白的细胞定位。结果 通过 ＲT-PCＲ、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验，表明 euchIL-10F 和 euchIL-10M 均整合入细胞基因组中，且 N1-euchIL-10M 在胞浆大量表达较强的绿色荧光，而 N1-euchIL-10F 表达的荧光较弱，且胞浆内含量很低。结论 去除信号肽利于 chIL-10 基因在体外真核细胞胞浆的表达。

治疗失眠中药小复方工艺筛选研究

范英兰, 张 宏, 甘 雨, 王光函, 张会宗, 乔 敏, 包玉龙, 武晓琳, 刘 禾, 王 菲

2017, 34(02):  21-25. 

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摘要: 目的 通过采用药效学与急性毒性实验，以综合评分法确定治疗失眠中药小复方的最佳提取工艺。方法采用对延长戊巴比妥钠催眠小鼠睡眠时间的实验及阈下催眠剂量影响的实验，并结合小鼠急性毒性实验进行筛选。结果 7 号药能使小鼠入睡潜伏期缩短，与模型组比较有明显差异( P ＜ 0. 05) ; 2、3、5、7、9 号药组致入睡小鼠数显著增加( P ＜ 0. 01、P ＜ 0. 01、P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01) ; 小鼠急性毒性试验确定了各受试药的 LD50。最终试验结果得出 7 号药的综合评分最高。结论 7 号药提取工艺为最佳工艺。

北京地区两个封闭群巴马小型猪的群体遗传质量分析

魏 杰, 王 洪, 巩 薇, 李晓波, 付 瑞, 王 吉, 邢 进, 冯育芳, 王淑菁, 高正琴, 岳秉飞

2017, 34(02):  26-30. 

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摘要: 目的 对北京地区两个封闭群巴马小型猪群体进行遗传质量评价与分析。方法 利用 DB11 /T828. 3 － 2011 中的 25 对微卫星引物，对 A、B 两个巴马小型猪群体进行微卫星分型及遗传参数计算。结果 A、B 两巴马小型猪群体分别得到 126 和 160 个等位基因，平均杂合度分别为 0. 6541、0. 6973，平均多态信息含量( PIC) 分别为 0. 6037、 0. 6605，两者的遗传距离为 0. 2650。结论 B 群巴马小型猪群体具有较好的遗传多样性和稳定性，符合封闭群动物的群体遗传特征。

稀有鮈鲫的组织学切片制作和苏木精-伊红染色

赵 颖, 赵德明, 王剑伟, 李爱华, 杨利峰

2017, 34(02):  31-34. 

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摘要: 目的 目前鲜有专门针对稀有鮈鲫这种新型实验动物进行组织切片制作方法的研究，故我们对此进行了实践、摸索以建立一完整的组织学切片制作流程供参考交流。方法 对正常生活状态下的健康稀有鮈鲫采用 Bouin`s 固定液固定，并用脱钙液软化骨骼后进行修块，组织块经梯度酒精脱水、松油醇透明之后，按照标准流程制成石蜡切片，HE 染色后封片用显微镜观察。结果 切片主要采取横断面和矢状面作为观察方位，并使用显微拍摄装备摄取了结构分明的各系统组织脏器的组织学照片。结论 本文所述的方法经过多次探索和实践，制得的组织切片镜检结果清晰，质量稳定，可作为以稀有鮈鲫等小型硬骨鱼为实验动物的切片制作提供一些可行的建议。

血络复欣颗粒对大鼠凝血功能及血小板聚集功能的影响

朱竟赫, 秦文艳, 薛彦杰, 齐 越, 包玉龙, 赵金明

2017, 34(02):  35-38. 

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摘要: 目的 研究血络复欣颗粒抗凝血作用及对血小板聚集功能的影响。方法 大鼠经腹主动脉采血，分离血浆并检测凝血酶时间( TT) 、凝血酶原时间( PT) 、活化部分凝血活酶时间( APTT) 、纤维蛋白原( Fib) 含量; 吸取富血小板血浆( PＲP) 及穷血小板血浆( PPP) ，以 ADP 为诱导剂，血小板聚集凝血因子分析仪，检测 2 min、4 min、6 min 血小板聚集百分率，计算出最大聚集百分率以及聚集抑制百分率。结果 血络复欣能够显著延长大鼠血浆的 PT、TT、 APTT，并显著降低 Fib 的含量，且显著降低以 ADP 诱导的大鼠血小板聚集率。结论 血络复欣具有显著的抗凝血以及抑制以 ADP 诱导的血小板聚集的作用。

FGF21 改善 STZ 诱导的 1 型糖尿病小鼠心肌纤维化的实验研究

陈 翠, 孟哲颖, 郑元义, 胡 兵, 申 锷

2017, 34(02):  39-43. 

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摘要: 目的 探讨 FGF21 对 STZ 诱导的 1 型糖尿病小鼠心肌纤维化的影响。方法 32 只 8 周龄雄性 C57 /BL6J 小鼠随机分为对照组( n = 6) ，FGF21siＲNA 对照组( n = 6) ，1 型糖尿病组( n = 10) ，1 型糖尿病 + FGF21siＲNA 组( n = 10) 。以 150 mg / kg 体质量的剂量单次腹腔注射 STZ 建立 1 型糖尿病小鼠模型，造模后行 FGF21siＲNA 给药。实验到达终点时，光镜下观察 Masson 染色心肌组织，电镜下观察纤维化程度，利用 real-time PCＲ 技术检测心肌组织Ⅰ 型( Col Ⅰ) 、Ⅲ型胶原( Col Ⅲ) 、TGF-β 及 FGF21mＲNA 的表达含量。结果 与正常组小鼠相比，STZ 诱导的 1 型糖尿病小鼠心肌细胞胶原纤维增生，伴随小鼠心肌组织 ColⅠmＲNA、Col ⅢmＲNA、TGF-βmＲNA、FGF21mＲNA 表达增加，经 FGF21siＲNA 处理后 FGF21mＲNA 减低，心肌细胞胶原纤维增生更明显，心肌组织 Col Ⅰ mＲNA、Col Ⅲ mＲNA、TGF-βmＲNA 的表达进一步增加。结论 FGF21 可改善 STZ 诱导的 1 型糖尿病小鼠心肌纤维化。

实验动物地方标准的查新和确认机制的建立及地方标准的应用

贺争鸣, 李根平, 陈梅丽, 肖 杭, 代解杰, 陆建玲, 白殿卿, 王 维, 刘福英, 陈洪岩, 赵 静, 任文陟, 李彧章, 黎 歌, 刘文菊

2017, 34(02):  44-50. 

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摘要: 实验动物地方标准是我国实验动物标准体系的重要组成部分。在科技主管部门和质检部门的指导和支持下，我国实验动物地方标准研究工作发展很快。建立实验动物地方标准查新与确认机制，控制执行标准的有效性，对保证实验动物工作的科学监管、实验动物质量检测工作的科学、准确、可靠意义重大。

EpiDerm 体外皮肤刺激性试验方法研究

李 丽, 郭玉东, 胡宇驰, 曹春然, 刘洪艳, 左泽平, 高 阳

2017, 34(02):  51-53. 

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摘要: 目的 评价 EpiDerm 体外皮肤刺激性试验方法的可行性。方法 取 EpiDerm 皮肤组织，加 30 μL 受试样品，每个样品平行操作 3 个，同时设阴性对照和阳性对照，作用 60 min，然后进行 MTT 染色、提取、570 nm 测定吸光度值，计算皮肤组织细胞存活率，进而判定受试物的刺激性。同时与体内家兔急性皮肤刺激性试验结果进行比较。结果 与体内家兔急性皮肤刺激性试验结果比较，EpiDerm 体外皮肤刺激性试验方法灵敏度、特异度、准确度均达到 100% ，且该方法测量结果客观、工作量小、避免了动物伦理问题。结论 EpiDerm 体外皮肤刺激性试验方法是目前最理想的体外皮肤刺激性替代方法。

高校实验动物信息管理平台的设计与应用

孟 霞, 张 伟, 乔 欣, 翟亚南, 刘晓楠, 王晶晶, 卢 静

2017, 34(02):  54-56. 

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摘要: 实验动物是高校教学科研工作中的重要实验对象和工具。为了提高实验动物管理的安全性和规范性，增加实验动物服务平台的技术服务水平，根据高等医学院校实验动物管理工作的特点构建了实验动物管理信息平台。文章从实验动物管理信息平台的设计理念、系统功能、技术特点、操作流程等方面进行了简要介绍。通过实验动物信息管理平台的运行，进一步提高了实验动物管理的规范化、科学化水平，完善了实验动物管理环节。

利血平致抑郁样啮齿类动物模型的研究进展

高雪松, 王永志, 李 丽, 赵静洁

2017, 34(02):  57-61. 

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摘要: 抑郁症是一种高患病率、高致残率、且有自杀倾向的慢性精神疾病，主要表现为情绪低落、悲观绝望等，严重者可影响个人日常生活。目前，随着对抑郁症研究的深入，抑郁症动物模型被广泛应用于实验研究。其中，利血平致抑郁样模型可以复制抑郁症的某些病理特征，该方法操作简便易行，可用于药物的初筛。本文综述了国内、外对利血平致抑郁样动物模型的相关研究，从该动物模型的一般情况、行为学、神经系统、免疫系统等方面的变化，分析该模型的特点、适用性及局限性，为研究人员应用利血平致抑郁样动物模型提供借鉴。

情志病证动物实验技术

周晴晴, 陈文强, 刘小菊

2017, 34(02):  62-65. 

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摘要: 随着人们生活节奏不断加快，不良情志刺激日益威胁人们健康，情志病证的研究已逐渐成为热点。在情志病证的研究中，动物实验开展较多，实验技术则至关重要。现就情志病证动物实验相关技术作一浅析，以期对现代情志病证的研究有所裨益。

大鼠心梗后心衰模型的制备及心功能评价

沈 明, 郭志福, 鲍礼智, 郑 兴

2017, 34(02):  66-70. 

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摘要: 心力衰竭是许多心血管疾病的最终阶段，严重威胁着人类的健康。大鼠心梗后心衰模型为深入研究心力衰竭的病理生理提供了实验基础。目前制备大鼠心梗后心衰的方法包括冠状动脉结扎、电凝法、冠脉微栓塞法、冷冻法、射频消融等方法，血流动力学、超声心动图及 BNP 等为筛选合格的心衰模型提供了评价技术手段。本文就大鼠心梗后心衰模型及心功能评价作了简要综述，为心力衰竭研究提供一些线索。

实验动物泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒检测方法的评价

祝岩波, 王俊霞

2017, 34(02):  71-73. 

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摘要: 泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒是实验动物重要的致病病原体，可引起呼吸系统、消化系统疾病，对动物的生产和动物实验可产生不良影响。本文对上述国家检测标准规定必须检测且有检测难度的三种病原体进行方法学总结，以获得更好特异性和敏感性的诊断方法; 提出传统方法初检、PCＲ 方法复检的方法以提高检测结果的准确性和可靠性。