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2017年 第34卷 第03期    刊出日期：2017-06-30

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研究 论著

原核系统表达的鸡白细胞介素-10 的鼠抗血清体内研究的初步分析

王丽廷, 王兴童, 杨柳, 彭蔚宇, 孟兴, 陈洪岩, 高文伟, 韩凌霞

2017, 34(03):  1-5. 

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摘要: 目的获得鸡白介素-10( chIL-10) 的原核表达产物，制备鼠抗血清，分析与真核系统表达的chIL-10 的反应原性。方法采用ＲT-PCＲ 从经脂多糖( LPS) 体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中扩增编码成熟IL-10 的基因，克隆至原核表达载体pET-30a( + ) ，成功构建原核重组质粒pET-chIL-10; 转化至大肠杆菌DH5α 中IPTG 诱导表达，切下含有重组蛋白的SDS-PAGE 胶条，免疫制备鼠抗血清; 分别与包含信号肽和去除信号肽的chIL-10 真核表达细胞系CHO-euchIL-10F 和CHO-euchIL-10M 进行间接免疫荧光抗体试验( IFA) 和蛋白免疫印迹试验( Western blot) ，验证有无反应性。结果成功构建chIL-10 的原核表达载体pET-chIL-10，获得了高效价的鼠抗血清，能与表达chIL-10的真核细胞系反应。结论原核表达的chIL-10 特异性鼠抗血清将能用于体内研究的检测。

二氮嗪对兔膝关节骨关节炎进展的影响的研究

陈康, 符红娜, 段招财, 陈泽俊

2017, 34(03):  6-9. 

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摘要: 目的研究二氮嗪对兔膝关节骨关节炎进展的影响，并探索其可能的作用机制。方法成年雄性新西兰大白兔20 只，通过切断兔双侧膝关节的前交叉韧带和内外侧半月板建立兔膝关节骨关节炎模型; 分为二氮嗪组和对照组各10 只，术后每周向二氮嗪组关节腔内注射二氮嗪溶液1 mL，对照组关节腔内注射蒸馏水1 mL。在第4 周时解剖兔膝关节，进行对比观察。结果4 周后，从实验动物活动表现和大体标本观察，二氮嗪组较对照组骨关节炎病变较轻( P ＜ 0. 05) 。结论二氮嗪对兔膝关节骨性关节炎的进展有一定的对抗作用。

癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠癫痫模型的影响

刘小虎, 刘 冉, 贾 东, 孟 莉, 齐 越, 甘 雨, 丁春晓, 乔菊久, 向绍杰

2017, 34(03):  10-15. 

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摘要: 目的 观察癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型的影响。方法 大鼠腹腔注射 10 g·L － 1 戊四唑 ( 40 mg·kg － 1 ) ，隔日 1 次，连续 4 周，停药 l 周后，再次注射相同剂量的戊四唑，根据癫痫发作级别随机分为 7 组每组 10 只，连续灌胃给药治疗四周，末 次 给 药 1 h 后除空白对照组外各组大鼠腹腔注射 10 g·L － 1 戊四 唑 ( 40 mg·kg － 1 ) ，记录各组大鼠癫痫发作级别，并通过 HE 染色观察癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型海马组织结构的影响，并通过免疫组化染色及免疫印迹法观察癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型海马组织凋亡因子表达的影响。结果 癫痫清颗粒组癫痫发作级别显著低于模型对照组，与模型对照组相比癫痫清颗粒可显著降低大鼠脑海马 CA1 区 AIF 和 BaX 的表达，与模型对照组相比癫痫清颗粒可显著增加大鼠脑海马 CA1 区 Bcl-X/ S + L 的表达。结论 癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型具有呈剂量依赖性的保护作用。

鸭瘟重组病毒穿梭载体的构建及分析

刘柏含, 牛银杰, 赵丽丽, 弥春霞, 陈洪岩

2017, 34(03):  16-19. 

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摘要: 目的 本研究目的为构建重组穿梭载体，拯救带有增强型绿色荧光蛋白( Enhanced green fluorescent protein， EGFP) 重组病毒，为重组二联苗的研制奠定基础。方法 选择已经证实的 US 区域的 US2-SOＲF3、US7-US8 和 UL 区域中的 UL15-UL18 的非编码区作为插入位点构建穿梭载体 P-US2-SOＲF3-EGFP，P-UL15-UL18-EGFP，P-US7- US8-EGFP。在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞( chicken embryo fibroblasts，CEFs) 中转染穿梭载体，经细胞同源重组，收集细胞上清，进行噬斑筛选及纯化。结果 成功构建了三个带有 EGFP 标签的穿梭载体，pBlusecript II SK 构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用 pUC18 构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑。结论 拯救鸭瘟重组毒的研究中，pBlusecript II SK 载体可能不是最佳的适用载体，也可能是插入位点为病毒复制的必须区。

益心通络胶囊体外抗凝血的生物活性测定法研究

肖 珠, 王志斌, 程 源, 王立娜, 郭玉东, 胡宇驰, 曹春然

2017, 34(03):  20-23. 

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摘要: 目的 考察以凝血酶时间( TT) 为反映体系建立益心通络胶囊体外抗凝血的生物活性测定法的可行性。方法将不同浓度的益心通络胶囊浸提液加入兔血浆中，测定凝血酶时间( TT) ，观察益心通络胶囊浸提液浓度与 TT 值的量效关系。规定浓度为 0. 261 g /mL 的益心通络胶囊溶液使空白血浆( 加 0. 9% 生理盐水) 凝血酶时间延长 1 个百分点定义为 1 个效价单位( U) ，定义并测得益心通络胶囊标准品效价。结果 当益心通络胶囊浸提液在 0. 1886 ～ 0. 2610 g /mL 浓度范围内时，凝血酶时间与浓度线性较好( r = 0. 9980; 0. 9985; 0. 9829) ; 测得益心通络胶囊标准品的效价为 2395 U/g。结论 益心通络胶囊体外凝血酶时间的生物活性测定方法具有可行性。

MDV 感染 B19、B21 单倍型 SPF 鸡免疫器官中 miＲ-146b-5p 的变化规律

易 诚, 陈洪岩, 韩凌霞, 王瑞琪, 杨春文, 廉传江

2017, 34(03):  24-27. 

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摘要: 目的 分析 miＲ-146b-5p 在 B19( MD 易感) 与 B21( MD 抗性) 单倍型鸡感染 MDV 后的表达变化规律，并探讨其可能与 MD 抗性/易感性相关的分子机制。方法 我们在 MDV 超强毒株 Md5 攻毒实验和前期高通量测序分析发现，miＲ-146b-5p 表达量有明显差异，为此进一步利用实时荧光定量 PCＲ 技术，检测 MD 感染 B19 和 B21 单倍型鸡 5dpi、10dpi 和 21dpi，miＲ-146b-5p 在法氏囊、胸腺和脾脏组织中的表达量变化情况。结果 miＲ-146b-5p 在 5dpi、 10dpi 和 21dpi 实验组和对照组的表达量明显不同，miＲ-146b-5p 在 B21 实验组中的表达量要远高于对照组，且差异显著; 而 miＲ-146b-5p 在 B19 实验组中的表达量高于对照组但差异不显著。结论 MD 感染后，在不同免疫器官中 miＲ-146b-5p 的表达量可能存在组织特异性，不同鸡系之间在感染后也存在一定的差异，但具体机制尚需进一步深入研究。

Fat1 转基因牛奶对小鼠健康和生殖能力的影响

宋丽爽, 高广琦, 魏著英, 白春玲, 苏广华, 张 立, 李光鹏

2017, 34(03):  28-33. 

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摘要: 目的 通过饲喂试验，分析 fat1 转基因牛奶对小鼠行为、健康和生殖能力等的影响。方法 取 4 周龄的 B6D2F1 /Vr 小鼠 36 只，随机分成 6 组，每组 6 只，雌雄各半。分别在饲料中添加 fat1 转基因牛奶、克隆牛奶和普通牛奶，对上述 3 组鼠进行饲喂。定期对饲喂小鼠进行称质量，并统计摄食量; 在饲喂 14 周后，每组小鼠均 1∶ 1合笼; 生育 3 次后，记录各组产仔量。同时，对每组小鼠进行血常规和血清生化指标分析。在整个试验期间，定期观察 3 组小鼠行为，并测量体质量。最后，处死小鼠，分别取各个器官进行称质量。结果 与饲喂普通牛奶组相比，饲喂转基因牛奶组和克隆牛奶组的小鼠在体质量、行为、繁殖能力和大部分重要的血液生理生化指标、组织器官的质量等方面均没有显著差异。结论 fat1 转基因牛奶对小鼠的健康和生殖能力没有明显不利的影响，表明 fat1 转基因牛奶对于动物的饮食是安全的。

某天然山泉水对高脂大鼠血脂及血流变学的影响

康爱君, 李雨薇, 田 枫, 王学文, 胡建国, 刘君芳, 郑振辉

2017, 34(03):  34-37. 

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摘要: 目的 观察某天然山泉水对实验性高脂大鼠血脂及血流变学的影响。方法 24 只 SD 大鼠根据血清总胆固醇( TC) 水平随机分为某天然山泉水组和模型对照组。采用高脂饲料喂养建立高血脂大鼠模型，在给予高脂饲料的同时，某天然山泉水组自由饮用某天然山泉水，模型对照组自由饮用自来水，连续饮用 60 d 后，采血测定血脂和血流变学指标。结果 与模型对照组比较，某天然山泉水组甘油三酯( TG) 显著降低( P ＜ 0. 05) ，低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C) 极显著降低( P ＜ 0. 01) ; 与模型对照组相比，某天然山泉水组切变率为 200s － 、100s － 和 50s － 时，全血黏度均极显著降低( P ＜ 0. 01) ，切变率为 10s － 时，全血黏度显著降低( P ＜ 0. 05) ; 红细胞压积显著降低( P ＜ 0. 05) 。结论 某天然山泉水具有降低实验性高脂大鼠甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的作用，也具有改善血流变学的作用。

流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌病多重荧光定量 PCＲ 检测方法的建立与初步应用

邢 进, 冯育芳, 岳秉飞, 贺争鸣, 孙晓梅, 代解杰

2017, 34(03):  38-42. 

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摘要: 目的 建立同时检测实验动物中的流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌的多重实时荧光定量 PCＲ( qPCＲ) 检测方法。方法 分别根据三种病原菌的 Hpd 基因和 KMT1 基因设计特异性引物和 Taqman 探针，经特异性、敏感性和重复性验证，建立多重 qPCＲ 检测方法，并对 822 份实验动物呼吸道样本进行检测应用。结果所建立的多重 qPCＲ 方法与其他 29 种病原菌间无交叉反应，对三种病原菌的检测限可达到 10 个拷贝/μL。树鼩样品中溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌的阳性率分别为 10% ( 6 /60) 和 21. 7% ( 13 /60) ，其他实验动物中均未检出上述三种病原菌。结论 本研究所建立的多重 qPCＲ 检测方法，可快速检测实验动物中的上述三种呼吸道病原菌。

异体抗原联合醋酸诱导大鼠慢性溃疡性结肠炎模型的优化与评价

张 俊, 吴定宇, 戴莉萍, 王朋川, 余万鑫, 余正勇, 刘 衡, 肖 怀, 杨志斌

2017, 34(03):  43-48. 

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摘要: 目的 优化及评价异体抗原联合醋酸诱导溃疡性结肠炎大鼠模型的建立方法。方法 以不同的抗原乳化液蛋白含量、不同醋酸浓度及醋酸在大鼠体内滞留时间作为变量，根据大鼠的疾病活动指数( DAI) 评分和结肠黏膜损伤指数( CMDI) 评分，筛选出最优的蛋白浓度、醋酸浓度及醋酸在大鼠体内滞留时间组合。结果 固定醋酸体内滞留时间为 13 s，以醋酸浓度和抗原乳化液蛋白用量为变量进行三水平的正交实验。抗原乳化液蛋白用量为 0. 1 mL 浓度 80 mg /mL，5% 醋酸溶液 1 mL 的造模组与正常组相比，DAI 评分、CMDI 评分差异显著，存活率高，炎症适宜。固定抗原乳化液蛋白浓度及醋酸浓度，分别考察醋酸在体内滞留时间为 13、15、18、20、22 s 造模情况，醋酸在体内滞留时间为 15 s 时，模型组 DAI 评分、CMDI、HS 评分与正常组相比差异显著，存活率高，炎症较为适宜。结论最佳 UC 造模条件为: 5% 醋酸溶液 1 mL 灌肠，滞留 15 s 后，4 mL 生理盐水冲洗，再以 1 mL 浓度为 8 mg /mL 的抗原乳化液蛋白灌肠，30 min 后，4 mL 生理盐水冲洗。造模后的溃疡性结肠炎模型成功率高，重复性好，死亡率低，大鼠结肠炎症严重程度适宜，且病变机制与人类 UC 相符，此复合型溃疡性结肠炎模型适合用于 UC 相关研究。

小鼠腺病毒荧光定量 PCＲ 方法的建立及初步应用

杜江涛, 宋晓明, 周莎桑, 吕 宇, 萨晓婴, 褚晓峰, 应华忠, 戴方伟

2017, 34(03):  49-54. 

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摘要: 目的 基于 TaqMan 建立小鼠腺病毒 ( MAdV) 特异的荧光定量 PCＲ 检测方法，用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中 MAdV 感染情况。方法 从 NCBI 下载小鼠腺病毒( MAdV-A 和 MAdV-3) 基因组序列，比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证，运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共 41 份样本进行检测。结果 经特异性和灵敏度鉴定，在设计的 3 对引物探针中确定一对最佳引物探针 MAD-3，可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等 24 种病原，MAdV 质粒 DNA 最低检测限为 4. 5 copies / reaction; MAdV 纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为 440 copies / reaction。结论 建立的 TaqMan 荧光定量 PCＲ 检测方法特异、灵敏和稳定，可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品 MAdV 的检测。

实验动物机构标识系统的比较研究

史光华, 张晓迪, 吕龙宝, 陈佳琦, 赵 玲, 王 芸, 徐彩银

2017, 34(03):  55-60. 

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摘要: 本文介绍目前实验动物生产、科研工作中使用的实验动物机构标识系统，着重分析了啮齿类动物及灵长类动物各种标识方法的优缺点以及机构设施标识的主要内容，为实际工作中实验动物及机构标识方法的选择提供参考。随着科技的发展，以无线射频技术( ＲFID) 为基础的新型标识技术，必将在实验动物领域中广泛应用; 应综合考虑各方面要素对机构标识进行系统性设置。

实验用猪微生物学质量控制标准的研究

任小侠, 吴思捷, 王锡乐, 范学政, 康 凯, 李根平, 姚文生

2017, 34(03):  61-65. 

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摘要: 实验用猪常作为科学研究与药品研发的靶动物，但其尚无相应的微生物学质量控制标准。本文采取文献分析法和改良德尔菲专家咨询法，研究实验用猪微生物学质量控制的病原微生物种类以及检测规则，探索并建立实验用猪微生物学等级及监测北京市地方标准，以期为北京市实验用猪的生产与使用单位在控制实验用猪的微生物学质量方面提供参考。

中国大陆地区实验动物机构、人员和设施现状分析

王锡乐, 巩 薇, 贺争鸣, 李根平

2017, 34(03):  66-70. 

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摘要: 本文目的是调查分析中国大陆地区实验动物机构、人员和设施的现状。通过对中国大陆地区 31 个省、直辖市、自治区和军队系统的调查分析发现，大陆地区实验动物许可证数量共计 1870 个，其中生产许可证数量为 422 个，使用许可证数量为 1448 个。调查还发现，实验动物行业的主力是企业，主要服务于医药卫生行业，而且提供综合性服务已经成为实验动物机构的发展方向; 实验动物从业人员的管理走向正轨，虽然科技人员在实验动物从业人员中的比例最高，但学历和职称整体偏低，需要加强人才培养; 实验动物生产和使用设施的面积以及建设经费投入逐年增大，但政府对生产设施建设的经费投入有待加强。

啮齿类实验动物的健康监测

王 迪, 宋志琦, 赵德明, 周向梅, 杨利峰

2017, 34(03):  71-75. 

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摘要: 实验动物在人类生命科学研究中发挥着极其重要的作用，为了确保科研数据的重复性与可信度，需对实验动物的健康进行全面监控。作者经过阅读相关文献资料，并结合本实验室多年来在北京实验动物安全检测上的工作经验，对实验动物监测的样本及方法提出几点建议。同时得出，某些动物虽无明显临床特征，且经微生物学( 病毒、细菌、真菌、支原体) 、寄生虫学检测均符合或接近国家相关标准，病理学检测却发现不同程度的组织损伤，表明仍有部分动物处于亚健康状态。综上所述，实验动物健康监测程序的建立和有效实施是至关重要的。

新一代基因组编辑技术在人类疾病动物模型中的应用

李莉红, 续国强, 卫佳宁, 宋国华

2017, 34(03):  76-80. 

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摘要: 基因编辑是一项对基因组进行定点修饰的新技术。基因编辑主要通过对目的基因的改造，达到未知功能基因研究和疾病治疗的目的。近年来，人工核酸酶介导的锌指核酸酶( ZFNs) 、转录激活因子样效应物核酸酶 ( TALENs) 及 ＲNA 引导的 CＲISPＲ-Cas 核酸酶( CＲISPＲ-Cas ＲGNs) 等新一代基因组编辑技术的兴起极大地推进了基因功能研究的进展，并在构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案方面有着重要的意义。本文就这 3 种基因编辑技术及其在人类疾病动物模型研究中的应用作一介绍。