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2018年 第35卷 第04期    刊出日期：2018-08-28

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研究报告

写在《实验动物管理条例》发布实施三十周年

贺争鸣，李根平，徐 平，陈洪岩，孙岩松， 荣瑞章， 李冠民，卢胜明， 高 翔， 潘振业，赵德明，江其辉， 肖 杭

2018, 35(04):  1. 

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《实验动物管理条例》（以下简称条例）是我国第一部关于实验动物管理工作的行政法规）《条例》实施30年来，在实验动物工作规范化、法制化管理，保障实验动物和动物实验的质量，推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。但随着科技进步、社会经济发展和立法工作的深入，实验动物科学研究和管理工作中出现了诸多新情况和新问题，《条例》在实验动物管理工作中的作用已不能完全适应科技创新、经济与社会发展的需要。因此，修订《条例》并将其上升到法律层面，对规范实验动物管理工作，保证实验动物质量，保障实验动物福利，维护公共卫生安全，支撑科技创新，以及促进国际科技合作与交流具有非常重要的意义。

MHC单倍体型无特定病原体鸭的培育

王兴童,孟 兴,佟相慧,陈洪岩,韩凌霞

2018, 35(04):  14. 

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目的 培育MHC单倍型无特定病原体单倍型鸭。方法 以国家禽类实验动物种子中心培育并保存的无特定病原体(SPF)麻鸭为基础，根据位于主要组织相容性复合体(MHC)核心区域的鸭抗原处理相关转运体分子(TAP)双拷贝基因(Tap1和Tap2)的多态性，分别利用Tap1基因组短串联重复序列(STR)、TAP2的肽结合区序列以及Tap2全基因组序列的基因型分型，连续选育主要组织相容性复合体(MHC)单倍型SPF鸭。结果 F0代和F1代鸭的STR结果完全一致；F2和F3代鸭的Tap1和Tap2基因组序列完全纯合。连续6个世代的Tap2基因组序列分析，B3群鸭有2个位点发生突变，B1、B2和B4遗传学稳定。结论 成功建立了4个MHC单倍体型SPF鸭群B1、B2、B3和B4，为深入开展鸭的免疫遗传学研究提供了实验动物支撑条件。

基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立

刘甦苏, 吴 曦, 周舒雅, 王辰飞, 左 琴, 李保文, 范昌发

2018, 35(04):  21. 

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目的 构建基于Cre- LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠，以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型，用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法 首先构建hRas打靶载体，电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，用正负法筛选阳性ES细胞，通过PCR、 Southern鉴定后，将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚，移入同步发育的受体鼠子宫，妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi，然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EIIa-cre)小鼠进行交配，获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠，并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果 成功构建了基于Cre- LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体，筛选得到的一个正确克隆，电转ES细胞后进行Southern blot鉴定，经过初筛和复筛，共获得12个阳性克隆，挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射，移植了48枚胚胎，出生9只小鼠，其中6只为嵌合鼠，将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL /6 J雌鼠进行交配，出生21只后代，其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠；hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠，其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠；hRasfl/fl小鼠与Tg (EIIa-cre)工具鼠交配6次，未有仔鼠出生；跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现，E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论 成功建立运用Cre- LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl，未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠，但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

王淑菁,林 欢, 付 瑞, 李晓波, 王 吉, 岳秉飞, 贺争鸣

2018, 35(04):  29. 

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目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法，并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列，设计1对引物和探针，可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度，并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL，标准曲线的线性关系良好，R2值可达0.99，灵敏度为101拷贝/μL，特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测，结果为2份阳性样本，经MVM、MPV特异性探针鉴定，2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对，一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法，能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。

补肾活血颗粒对多囊卵巢综合征大鼠血清性激素水平、 血糖及胰岛素的影响

孙婉莹，孙树文， 赵润琴， 董培良， 李振宇， 张晓燕

2018, 35(04):  33. 

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目的 观察补肾活血颗粒对多囊卵巢综合征（PCOS）模型大鼠血清性激素水平、血糖及胰岛素的影响。方法 采用颈背部皮下注射脱氢表雄酮（DHEA）造模法建立PCOS大鼠模型，将72只雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、二甲双胍组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，每组12只，各组给予相应药物连续灌胃 20 d，用酶联免疫吸附测定法测定血清17-羟孕酮（17-OHP）、促黄体生成素（LH）、睾酮（T）、促卵泡素（FSH）、空腹 血糖（FPG）及胰岛素（INS）水平。结果模型组血清中17-OHP、LH、T、FSH、FPG、INS水平明显高于正常对照组 (P<0.01 ，P<0. 05 )，中药高剂量组降低大鼠血清LH、T、FSH及INS水平最为明显(P<0.01),二甲双胍组、中药中剂量组显著降低FPG（P<0. 01）,中药各治疗组均能降低17-OHP（P<0. 05）。结论 补肾活血颗粒能对PCOS 大鼠有一定的治疗作用，可改善激素水平、血糖及胰岛素的异常

血管张力在大鼠血栓栓塞大脑中动脉脑梗死模型中的应用

刘晓静，蔡桂兰， 毕鸿雁， 陈 旭，张拥波

2018, 35(04):  37. 

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目的 利用血管张力固定改良PE管，制作血栓栓塞大脑中动脉脑梗死（Embolic middle cerebral artery occlusion, eMCAO）大鼠模型。方法 采用清洁级Sprague-Dawley大鼠20只制作eMCAO模型，均为单人制作，利用血管张力固定改良PE管。 结果 改良PE插管均成功，大鼠eMCAO造模成功率90%，制作时间每只平均30 min。 结论 利用血管张力法可单人操作制作大鼠eMCAO模型，有效节省造模所需时间以及人力物力。

铜绿假单胞菌注射液对H22小鼠移植瘤的辅助治疗效果

饶子亮，郑佳琳， 黄 威，王 弋，潘诗云， 黄绮玲， 邝少松

2018, 35(04):  40. 

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目的 研究铜绿假单胞菌注射液联合化疗对H22小鼠移植瘤的影响。方法 采用H22细胞株，移植53只BALB/c小鼠皮下。取肿块大小相对均匀的48只小鼠随机分成6组：空白对照、铜绿假单胞菌组、联合顺铂组、联合阿霉素组、顺铂组、阿霉素组，8只/组。连续给药14 d。结果 联合顺铂组、顺铂组的抑瘤率为49.2%、46.6%，联合阿霉素组、阿霉素组的抑瘤率为32.1%、19.8%。结论 铜绿假单胞菌注射液对H22小鼠移植瘤的阿霉素化疗有一定的增强效果。

安神脐贴对实验性失眠模型大鼠自主活动及血清GABA、NE含量的影响

甘 雨，马 进，乔 敏，张 宏， 包玉龙， 武晓琳， 刘小虎 ，焦富英

2018, 35(04):  45. 

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目的 探讨安神脐贴对实验性失眠模型大鼠自主活动及血清γ-氨基丁酸(GABA)、去甲肾上腺素(NE)含量的影响，以揭示其促眠作用机制。方法 采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)复制大鼠失眠模型，40只大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、安神脐贴(2.70 g/kg体质量)组和地西泮(0.90×10-3g/kg)组。观察大鼠一般状况和自主活动情况，并采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清GABA、NE含量。结果 与模型对照组比较，安神脐贴组和地西泮组大鼠体质量明显增大(P<0.05)，自主活动中移动距离和速度显著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央区出现频率和在中央区停留时间也有所下降。经安神脐贴和地西泮治疗后，大鼠血清中GABA含量显著升高(P<0.01)，NE含量显著下降(P<0.01)。结论 安神脐贴能改善失眠大鼠一般状况，减少自主活动，其促眠作用机制可能与增加GABA分泌，减少NE释放有关。

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

张越华 ，郑秀

2018, 35(04):  49. 

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目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物，构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系，优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增，无交叉反应；对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL；也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点，为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

冯育芳， 邢 进， 王 吉， 付 瑞， 岳秉飞

2018, 35(04):  56. 

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目的 建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法，并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法 针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和TaqMan探针，使用分子生物学方法制备质粒标准品，建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法；对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定；并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果 成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法；该方法线性范围为1.0×101 copies/μL～1.0×109 copies/μL，相关系数为0.998，检测极限达10 copies/μL；特异性结果显示所建方法具有良好的特异性，并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论 实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。

成年小鼠大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除的认知功能研究

黄忠兴， 何宏星， 王亚新， 邢作超， 周常文， 林炤华

2018, 35(04):  61. 

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目的 探讨成年小鼠大脑神经细胞特异性ADAM10基因缺失后对小鼠行为的影响。方法 通过Y迷宫、高架十字迷宫以及旷场实验，了解ADAM10 基因敲除后，对小鼠的自主活动能力、探究学习能力的影响。结果 行为学实验结果显示ADAM10基因敲除小鼠的自主活动能力较对照组小鼠有所下降，其在新环境中探索的次数、时间和路程较对照组明显减少。说明了脑内神经细胞ADAM10 基因的缺失对成年小鼠的自主活动能力和探究学习能力都产生了一定的影响。

研究简报

IVC笼盒原位实施小鼠二氧化碳安乐死方法的建立

庞 帅， 师晓萌， 鹿双双，吴 健， 史光华， 刘晓宇， 卢选成

2018, 35(04):  67. 

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目的 建立一种在原饲养IVC笼盒中实施小鼠二氧化碳安乐死的方法。方法 将4～5周龄BALB/c小鼠、4～5周龄C57BL/6小鼠和2周龄C57BL/6小鼠各10只，按照5只/笼的标准饲养。以28%容器体积/min气体置换率，将二氧化碳通入小鼠饲养笼实施安乐死。结果 4～5周龄BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均在2～3 min之间失去意识，5～6 min之间死亡，与美国国立卫生研究院指南中要求的一致。2周龄C57BL/6小鼠死亡需要的时间长于4～5周龄C57BL/6小鼠，并有显著性差异。结论 成功建立了小鼠在原饲养IVC笼盒中实施二氧化碳安乐死的方法。该方法有效降低了小鼠应激反应，提高了动物福利；且有利于操作人员身心健康。

异氟醚全凭吸入诱导下大鼠经口气管插管的方法比较

龚 廷，薛佩彤，张 振

2018, 35(04):  71. 

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目的 探讨异氟醚全凭诱导麻醉下更快捷有效的大鼠气管插管方法。方法 将40 只大鼠随机分成经口可视喉镜组和经颈透照直视组两组，比较插管时间、插管次数、一次插管成功率。结果 经口可视喉镜组的插管操作时间、插管次数、一次插管成功率均优于经颈透照组(P<0.05)。结论 采用自制器材的经口可视喉镜插管法优于经颈透照直视组插管法

医务工作者对实验动物福利认知的调查和分析

陈丽娟，贾连群， 袁东超，隋国媛，战凯璇， 杨关林

2018, 35(04):  74. 

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目的 通过调查与分析对实验动物福利的认知情况，为对医务工作者实行实验动物福利的教育及培训提供依据及策略。方法 查阅相关文献、图书等资料，分析现阶段类似问卷，总结相关问题自制问卷；选择涉及实验动物工作的医院临床工作者、高校科研工作者作为调查对象，随机选取并发放调查问卷。结果 医务工作者对动物福利概念及相关内容了解者仅占50%或以下。在不同身份的医务工作者对实验动物福利内容认知的差异性比较中，动物实验开展前进行预实验情况与实验之前已经掌握实验步骤情况，科研工作者优于其他两者(P<0.05)；了解我国实验动物福利相关法律和曾经接受过实验动物福利相关的教育方面，医学生优于其他两者(P<0.05)。结论 医务工作者对实验动物福利认知度参差不齐，整体较差，有必要加强实验动物福利相关的培训，尤其是对有动物实验需求的临床工作者。

研究进展

DNA条形码在农用动物中的应用

于鹏丽 ，岳秉飞

2018, 35(04):  79. 

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DNA条形码技术作为近年来分子标记研究的热点，发展十分迅速，但在农用动物中的应用的相关报道还很少见。本文通过对DNA条形码的发展历程、原理和技术流程及其在肉类等鉴定中的应用等方面阐述了DNA条形码在农用动物中应用的前景和局限性，为农用动物的鉴定提供了新的思路和方法。

哮喘动物模型建立的研究进展

张睦涵， 朱振刚

2018, 35(04):  83. 

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通过对近10年国内,外支气管哮喘动物建模方面实验研究的回顾与整理，总结哮喘动物模型建立及评价方面最新进展，发现过敏性哮喘模型仍是最经典与广泛复制的模型类型，而基于哮喘表型与异质性因素而提出的中性粒细胞哮喘、难治性哮喘模型的复制也取得一定进展。