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2015年 第32卷 第05期    刊出日期：2015-10-31

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研究 论著

利用CRISPR-Cas9 构建syncytinA 条件敲除小鼠

孙丹, 龙华洋, 庄英华, 丁明芹, 李金平, 江世文

2015, 32(05):  1-6. 

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摘要: 目的构建syncytinA( 合胞素A) 条件敲除小鼠，为进一步研究syncytinA 在胎盘形成过程中发挥的融合及非融合作用及研究子痫前期病理模型提供基础。方法在用ES 细胞打靶完成syncytinA 外显子上游loxp 同源重组基础上，利用CRISPR-Cas9 得到syncytinA-loxp 小鼠。构建syncytinA-loxp 转基因载体及sgRNA，通过原核显微注射方法将构建好的doner、Cas9 及sgRNA 一并注射到C57 小鼠受精卵中，并移植入同期受孕代孕受体ICR 输卵管中获得子代小鼠。用PCR 方法检测子代鼠尾基因型， loxp 阳性小鼠与WT 交配获得syncytinA-loxp 小鼠。为了检测syncytinA-loxp 能否被敲除，通过与prime1cre 及zp3cre 交配获得syncytinA － / － ，PCR 及q-PCR 检测syncytinA 是否被敲掉。结果经PCR 及q-PCR 方法检测，我们成功得到syncytinA － / － 胚胎。结论syncytinA 条件敲除小鼠构建成功，为更好的研究它在胎盘及子痫前期中的功能提供了基础。

夹板外固定大鼠胫骨闭合性骨折模型的建立

王峰, 罗婷婷, 李宪起

2015, 32(05):  7-10. 

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摘要: 目的通过建立大鼠闭合型胫骨骨折模型，为探讨骨折生理愈合机制提供实验依据。方法对14 只8 周龄雄性SD 大鼠通过自行设计的大鼠骨折造模支架行胫骨中段闭合性骨折，自制外夹板复位固定，并分别于骨折后0，7， 14， 21， 28 d 拍摄X 线观察骨折类型以及骨折的愈合情况。结果X 线显示10 只为横行骨折，3只斜形骨折，1只为粉碎性骨折，并呈典型的二期愈合过程。结论自行设计的大鼠骨折造模支架及自制夹板外固定制作的大鼠闭合型胫骨骨折模型操作简便，减少了造模过程中人为的软硬组织损伤对骨折的影响，符合闭合性骨折模型的要求。

小鼠巨细胞病毒PCR 诊断方法的建立及其应用

杜凯, 吴德国, 赵德明

2015, 32(05):  11-14. 

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摘要: 目的建立小鼠巨细胞病毒( MCMV) PCR 检测方法，并进行初步应用。方法根据NCBI 公布的巨细胞病毒设计引物，进行PCR 体系优化、敏感性、特异性测试; 运用优化后的方法，对87 份小鼠血清进行检测，对阳性样本进行测序分析。结果建立的小鼠巨细胞病毒PCR 方法灵敏度高，特异性好，初步检测4 个屏障设施的87 份小鼠血清， 13 份为阳性，通过测序证实为小鼠巨细胞病毒，验证了此方法的可行性。结论为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法。

绿色荧光裸鼠部分免疫学指标的测定及分析

尤金炜, 刘彪, 张旭亮, 马畅, 董敏, 赵志刚, 恽时锋

2015, 32(05):  15-17. 

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摘要: 目的检测绿色荧光蛋白( Green Fluorescence Protein，简称GFP) 转基因裸鼠的部分免疫学指标，分析GFP 转基因裸鼠与其他小鼠在免疫学方面的优缺点，为将来的研究提供基础参考值。方法① 实验选用6 ～ 8 周GFP 转基因裸鼠、BALB/c 裸鼠和BALB/c 小鼠，活体称体质量，剖取脾脏称其质量，之后进行脾淋巴细胞增殖能力的测定。② 取外周血，测定部分血常规指标及免疫球蛋白指标。结果① GFP 转基因裸鼠脾脏质量、脾脏系数以及T、B 淋巴细胞增殖反应与BALB/c 裸鼠相近，但与BALB/c 小鼠差异显著。② GFP 转基因裸鼠、BALB/c 裸鼠两种裸鼠品系外周血白细胞水平、淋巴细胞以比例及免疫球蛋白IgG、IgM 都远低于BALB/c 小鼠，差异显著。结论从脏器系数、白细胞水平，免疫球蛋白水平等角度发现，GFP 转基因裸鼠和BALB/c 裸鼠的免疫系统水平较BALB/c 小鼠相弱，其中GFP 转基因裸鼠的免疫系统水平最为低下。

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

王淑菁,付瑞,李晓波,王吉,岳秉飞,贺争鸣

2015, 32(05):  18-21. 

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摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法，并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列，设计引物和探针，建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围，特异性及灵敏度，并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL，标准曲线的线性关系良好，R2 值可达0. 99，灵敏度为101 拷贝/μL，特异性强，与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测，结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点，为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。

H-1 细小病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6 机制的初步探讨

付瑞, 李晓波, 王淑菁, 王吉, 卫礼, 岳秉飞, 贺争鸣

2015, 32(05):  22-25. 

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摘要: 目的探讨H-1 细小病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6 后细胞因子水平的变化。方法取感染C6 细胞后不同时间点的H-1 细小病毒，同时取相同时间点的正常C6 细胞，采用ELISA 方法检测同时检测TNFα、IL-6、TGF-β1和IL-17A 的表达水平。结果正常C6 细胞中TNF-α、TGF-β1 和IL-17A 的浓度随培养时间增长而提高， IL-6 浓度无明显变化; H-1 细小病毒感染的C6 细胞中TNF-α、TGF-β1 和IL-17A 浓度无明显变化，而IL-6 浓度随感染时间推移而显著增加。结论H-1 细小病毒感染导致C6 细胞中细胞因子表达水平的变化。

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

吴曦, 周舒雅, 刘甦苏, 谷文达, 左琴, 李保文, 贺争鸣, 范昌发

2015, 32(05):  26-30. 

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摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA，为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体，通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录，与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率，计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%，使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠，其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA，从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性，表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。

森林脑炎灭活疫苗对新西兰白兔肌肉刺激及豚鼠全身过敏试验

赵红丽, 戴龙, 杨红育, 刘智慧, 刘辉1 孙宏亮1 王琳麟1 杨淑苹

2015, 32(05):  31-34. 

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摘要: 目的比较生产场地变更前后森林脑炎灭活疫苗对新西兰白兔肌肉的刺激性和豚鼠的全身过敏反应，评估生产场地变更后森林脑炎灭活疫苗的动物安全性。方法采用两个生产场地各3 批森林脑炎灭活疫苗，其对新西兰白兔肌肉刺激试验进行对比分析，将12 只新西兰白兔随机分为两组，每组6 只，雌雄各半。两个生产场地均设佐剂对照组和森脑疫苗试验组，采用同体左、右侧自身对比法。分别于左、右侧股四头肌肌内注射佐剂和森脑疫苗。临床观察至第3 天解剖。大体剖检、常规病理制片、病理组织学检查及显微摄影记录。全身过敏试验取豚鼠6只，每只腹腔注射0. 5 mL，间日一次，连续3 次，每日观察每只豚鼠的行为和特征。首次致敏和激发前称量每只豚鼠的体质量，然后分成两组，每组3 只，分别在第一次注射后第14 日及第21 日静脉注射供试品1 mL，观察30 min。结果注射森脑疫苗后，有与佐剂对照组相似的肌肉刺激性损伤。生产场地变更前后，注射森脑疫苗局部肌肉组织的病理改变未见明显差异。结论生产场地变更后森脑疫苗与生产场地变更前森脑疫苗效力相同，具有可靠的动物安全性。

5 /6 肾切除小鼠中矿物质与骨代谢紊乱的特征

周晨辰, 张颖慧, 戴兵, 刘亚伟, 孙丽君, 徐成钢, 郁胜强, 梅长林, 薛澄

2015, 32(05):  35-39. 

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摘要: 目的通过制备5 /6 肾切除( 5 /6 Nx) 小鼠慢性肾脏病( CKD) 模型，观察小鼠成纤维生长因子23( FGF23) 及钙磷代谢指标，有助于研究矿物质与骨代谢紊乱的发病机制。方法28 只C57 雄性小鼠适应性饲养1 周后，切除模型组约5 /6 左肾，1周后切除右肾， 16 周后处死后收集血尿和肾脏组织标本，常规检测血尿FGF23、甲状旁腺素( PTH) 、活性维生素D、钙、磷等指标，观察肾脏病理。结果与假手术组和正常对照组相比，术后16 周5 /6 Nx 小鼠出现体质量减低，血清FGF23、PTH，血磷等异常升高，活性维生素D 水平显著降低，尿蛋白增加。肾脏病理发现系膜基质增生、胶原沉积及纤维化明显，和肾小球代偿性肥大。结论5 /6 Nx 小鼠可以出现明显的矿物质与骨代谢紊乱特征，是研究CKD 骨病合适的模型。

首都医科大学实验动物学科建设10 年回顾

陈振文

2015, 32(05):  40-42. 

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摘要: 本文以首都医科大学实验动物学科建设的历程为主线，着重阐述了医学院校开展实验动物学科建设的必要 性和优势条件，展示了实验动物学科建设内容和十余年的建设成果，为医学院校开展实验动物学科建设提供有益 参考。

三种常用麻醉剂对长爪沙鼠麻醉效果观察

梁亦渊, 李顿晴, 杨一帆, 李振坤, 蒋辉, 李长龙, 杜小燕, 郭萌

2015, 32(05):  43-46. 

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摘要: 目的分析比较3 种不同麻醉剂对长爪沙鼠的麻醉效果。方法成年长爪沙鼠分为3 组，分别腹腔注射水合氯醛、乌拉坦和戊巴比妥生理盐水溶液，观察麻醉诱导时间、麻醉期、苏醒时间及心率和呼吸变化，并与大、小鼠进行比较。结果长爪沙鼠在注射水合氯醛后麻醉保持时间最长，而乌拉坦最短。水合氯醛对呼吸和心跳的抑制能力较弱于乌拉坦和戊巴比妥。除了乌拉坦，其余两种药物对长爪沙鼠的麻醉时间均较大，小鼠更长一些。结论3 种麻醉药对长爪沙鼠的麻醉效果明显不同，对其呼吸和心跳频率的影响也有差别，可以根据不同的实验要求选用这三种麻醉剂。相对于大、小鼠来说，长爪沙鼠对3 种麻醉剂都更敏感。

实验动物突发重大疫病应急处置演习

迟晓丽, 刘文菊, 王锡乐, 法云智, 范薇, 赵德明, 贺争鸣, 李根平

2015, 32(05):  47-50. 

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摘要: 实验动物的生物安全是实验动物学科发展的重要前提，更是实验动物科学管理工作的底线。经过数十年的发展，我国实验动物行业已取得明显进步，但针对实验动物的生物安全处置体系尚不健全，面对突发重大实验动物疫病更是缺少长效的应急管理机制。为加强我国突发重大实验动物疫病应急处置体系建设，检验实验动物突发重大疫病应急预案，北京市实验动物管理办公室于2015 年11 月6 日组织了实验动物突发重大疫病应急处置演习。实践证明，本次实战演练有效地检验了预案，表明本预案方案严谨、内容科学、流程顺畅，但同时也反应出我国实验动物疫病应急处置体系中亟待解决的问题。

医用输液、注射器和卤化丁基胶塞的溶血性测定

高保栓, 袁丽华, 刁立琴, 常秀玲, 刘英绵, 康莉

2015, 32(05):  51-54. 

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摘要: 目的通过测定河北省内生产、销售或正在使用的医用输液器、注射器具和注射用卤化丁基胶塞的溶血性，以评价其生物安全性。方法依据国标，采用体外静态直接接触溶血法，以实验兔心脏血为材料，分别测定了一次性输液器、一次性无菌注射器和注射用卤化丁基胶塞各10 批样品的溶血率，并对该3 类产品体外溶血程度进行了比较。结果所测样品的溶血率均＜ 5%。结论所测样品的溶血性均符合相关产品标准的规定，表明该3 类产品在溶血方面具有一定的生物安全性。

线栓法制备大鼠脑缺血模型的研究进展与思路

翟小虎, 王斌, 宋亚刚, 沈甜, 马忠英, 文爱东

2015, 32(05):  55-58. 

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摘要: 线栓法在脑缺血再灌注模型的制备中应用广泛，但影响其成功率的因素有很多种，本文意于寻求一种更加有效的模型制作方法。通过查找大量文献，对相关文献进行归纳和总结。在对缺血性脑血管疾病的研究过程中，脑缺血实验动物模型为非常重要的研究途径，而在模型制作过程中大鼠的选择、麻醉药品使用、栓线的使用和手术方法等都是影响模型能否成功的关键要素。本文便是对线栓法制作大鼠局部脑缺血动物模型的方法和特点作一综述及介绍。

人体肿瘤PDX 移植模型的优与劣

胡斌权, 陈城明, 张同弟, 李天, 师长宏

2015, 32(05):  59-62. 

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摘要: 介绍人体肿瘤移植( patient-derived tumor xenograft model，PDX) 模型的基本特征和在生物医学研究中的应用;比较该类模型应用于肿瘤研究的优点和存在的问题。目的是正确应用PDX 模型开展研究工作，分析相应的实验结果，加快肿瘤药物研发进程。